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基因工程详细概述



基因工程详细概述



第一章 绪论

一、基因的分类

(1)结构基因

是指某些能决定某种多肽链(蛋 白质)或酶分子结构的基因。

(2)调控基因

是指某些可调节控制 结构基因表达的基因。

二、基因工程的三大要素

供体-目的基因等

受体-动植物、微生物细胞等

载体-质粒、噬菌体、病毒

三、基因工程的发展

第一个实现DNA重组的人-Berg 1972

第一个取得基因工程成功的人-Cohen 1973(基因工程诞生)

四、三大发现与三大发明

(1)三大发现

40年代证实DNA是遗传物质

50年代,DNA的双螺旋模型的提出 和DNA复制机理的阐明

60年代,确定了遗传信息的传递方式 (中心法则)

(2)三大发明

限制酶的发现与DNA的切割

DNA连接酶的发现与DNA的连接

基因工程载体的发现

五、基因工程基本流程



第二章 工具酶

一、限制酶

(1)概念

一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。

(2)命名

用具有某种限制性酶有机体的属名第一个字母(大写)和种名的前两字母(小写)组成3个字母的略语作为该酶的基本名称。

如果酶是存在于特殊的菌株中,还应在第3个字母后面标注菌株名称的符号株或型(strain) 。

如果一种特殊的菌株具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示该菌株中发现某种酶的先后次序。

(3)种类

Ⅰ型酶: 分子量较大,反应需Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点,而且切割是随机的,所以在基因工程中应用不大。

Ⅱ型酶(重点):分子量通常较小,只有一种多肽,以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+的存在。

识别位点是一个回文对称结构,并且切割位点也在这一回文对称结构上。

许多Ⅱ型酶切割DNA后,可在DNA上形成粘性末端,有利于DNA片段的重组。

Ⅲ型酶:这类酶可识别特定碱基序列,并在这识别位点下游的3’端24~26 bp处切开DNA,所以它的切割位点也是没有特异性的。



(4)识别序列

绝大多数II型限制性内切酶都能识别由4-6个核苷酸组成的特定序列。

限制性内切酶是在DNA分子双链的识别序列内切割DNA分子,因此识别序列又称为该限制性内切酶靶序列。

限制性内切酶II的识别序列具有双重(180度)旋转的对称结构,也就是说识别序列的核苷酸对是呈回文结构。、

(5)同尾、同位、同裂

同尾酶——识别序列不同,产生相同的粘性末端。

同位酶——识别序列相同,切割位点不同。

同裂酶——一些来源不同的限制性内切酶,具有相同的识别位点和切割位点。

(6)星活性

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等条件下,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性变化即所谓的Star activity现象。

二、连接酶

(1)特点

连接的两条链必须分别具有3′端自由羟基(-OH)和5′端磷酸基团(-P),而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应;

在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程,因此连接反应必须有能量分子的参与,通常有两种能量分子,即ATP和NAD+。

(2)反应条件

连接反应最佳温度为37℃,但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定,而且酶活性也会迅速降低。比如,EcoR I 粘性末端连接部位只有4个碱基对,很容易断开。所以通常在4-16℃连接。

影响连接效率的因素有:

A. 温度

B. ATP的浓度

C. 连接酶浓度(平末端较粘性末端要求高)

D. 反应时间(通常连接过夜)

E. 插入片段和载体的摩尔比

三、DNA聚合酶

(1)大肠杆菌DNA聚合酶I

三种活性:DNA聚合酶活性、3′→5′外切酶活性、5′→3′外切酶活性

用途:

A. 制备高比活度的DNA探针

利用其5′→3′的外切酶活性及其聚合酶活性。

B. 用于DNA连接后的大缺口填充

利用5′→3′的聚合酶活性。

C. 用于DNA的序列分析

利用5′→3′的聚合酶活性。

Sanger法

Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见DNA碱基序列的一种方法

(2)Klenow片段(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段)

活性:5′→3′的聚合酶活性、3′→5′外切酶活性

用途:

补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端

DNA片段的同位素末端标记

(3)Taq酶

活性:具有5`-3`聚合酶的活性、具有3’-5’外切酶活性

特征:

热稳定性

特异性(退火温度与反应温度有明显差距)

延伸长度

合成产率高

忠实性(错误率低)

(4)逆转录酶

活性:RNA指导的DNA聚合酶活性

RNase H活性

DNA指导的DNA聚合酶活性

用途:合成第一链cDNA

制作cDNA探针

测序

(5)修饰酶

末端脱氧核苷酸转移酶TdT

用途:

给载体和外源DNA分子分别加上互补的同聚物尾巴,以便二者在体外连接。

碱性磷酸酶CIP

用途:

在DNA分子的体外重组中,为防止线性化的载体分子发生自我连接作用,常用碱性磷酸酶进行脱磷酸处理。

能够催化核酸分子(DNA或RNA)脱掉5`磷酸基团,从而使核酸分子片段的5’p末端转换成5’OH末端。这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。

(6)核酸酶

第三章 载体

一、载体分类

(1)根据来源和性质划分

质粒载体

噬菌体载体

粘粒载体

人工染色体载体(酵母、细菌)

噬菌粒载体

病毒

(2)根据受体细胞不同划分

原核生物载体

真核生物载体

大肠杆菌载体

酵母载体

植物基因工程载体

动物基因工程载体

(3)根据功能和用途划分

克隆载体

表达载体

转化载体

测序载体

穿梭载体

整合载体

二、载体的功能

(1)运送外源基因高效转入受体细胞

(2)为外源基因提供复制能力或整合能力

(3)为外源基因的表达提供必要的条件

三、载体应具备的条件

(1)自身分子量较小,在寄主细胞中的拷贝数高,易于操作和DNA的制备。

(2)能在宿主细胞内进行独立、高效稳定的自我复制。

(3)要有合适的限制性内切酶的识别、切割位点。但限制性内切酶的切割位点最好是单一的,且不在DNA复制的必需区;具有较高的DNA装载能力。

(4)具有1-2个选择标记基因,如对抗生素的抗性基因等,易于后期重组子的选择。

(5)有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达,并且尽可能是高效的表达。

(6)从安全角度考虑,要求载体不能随便转移,仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。

四、载体的一般结构特征



五、质粒载体

(1)质粒的复制类型

一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。

据拷贝数将质粒分为两种复制型:“严紧型”质粒(stigent plasmid),拷贝数为1-3;“松弛型”质粒(relaxed plasmid),拷贝数为10-60。不过,即使是同一质粒,其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。

(2)质粒的不亲和性

在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。

(3)质粒的存在形式

超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种

(4)质粒的命名规则

天然质粒:第一个字母大写

如F质粒、R质粒、Col(colicins )质粒等。

重组质粒:通常小写字母p,后加两个大写字母表示。

如pBR322

(5)改造思路

去掉不必要的DNA区域,保留复制子等必要部分,尽量缩小质粒分子量,以提高外源DNA片段的装载量。

减少限制性内切酶的酶切位点。

加入易于检测的选择性标记(标记基因)。

关于质粒的安全性改造,保证质粒载体不随便转移。(避免滥交质粒)

改造或增加基因表达的调控序列。

(6)α-互补(蓝白筛选)

大肠杆菌β-半乳糖苷酶(α-片段和ω-片段) 可以和其底物X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物质,当该酶的α-片段和ω-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶α-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中,而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的ω片段。这样一来,含有功能性完整的LacZ基因的载体导入到这类寄主细胞中时,载体编码的α-片段就能和寄主编码的ω-片段发生互补并具有了对底物X-Gal的作用功能(发生显色反应),这种现象被称为 alpha-complementation

(7)插入失活(insertional inactivation)

在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后,导致抗四环素基因失活,变成只对氨苄青霉素有抗性,这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中,这种筛选方法称为插入失活。

(8)T载体(T vectors PCR克隆载体)

用途:大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

(9)几种重要载体

pBR322(原始载体)



优点:

① 具有较小的分子量

它的分子量为4363bp,克隆外源DNA的分子量大小不超过10 kb。

② 具有两种抗生素抗性基因

pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶的单一酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部,2种识别位点在于这个基因的启动区内,所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活;另外有3种限制酶在Ampr基因有单一的识别位点。


pUC质粒载体(克隆载体)



优点:

① 具有较小的分子量和更高的拷贝数

平均每个细胞500-700个拷贝(甚至高达3000)。

② 适用于组织化学检测重组体

具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因,所编码的α-肽链可参与α-互补作用,用X-Gal显色对重组子进行鉴定,而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。

③ 具有多克隆位点MCS区段

方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。


pET30(a-c)(原核表达载体)



六、噬菌体

(1)生物学特性

噬菌体的生长周期可分为溶菌周期和溶源周期两种类型。

前者指噬菌体将DNA注入寄主细胞后环化,然后自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装,最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体(最快20min)。

后者指噬菌体将DNA注入寄主细胞后,噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上并随着寄主细胞的分裂而进行复制。

只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。

只有溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。

(2)cos位点

当λ噬菌体进入寄主细胞后,粘性末端通过碱基互补作用,形成环状DNA分子,粘性末端形成的双链区域称为cos位点。

(3)改造思路

缩短长度

删除重复的酶切位点

加装选择标记

构建琥珀密码子的突变体

(4)λ-DNA载体的主要类型

插入型载体(insertion vector): 通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。

置换型载体(replacement vector,又称取代型载体):允许外源DNA片段替换非必需DNA片段的载体。

七、M13噬菌体

(1)结构

M13是丝状的大肠杆菌噬菌体,颗粒内含有6.4k核苷酸的闭合环状单链DNA(+)基因组。

(2)复制方式

滚环式复制(rolling circle replication):是噬菌体中常见的DNA复制方式。环形DNA分子从其复制起始点开始复制,导致复制泡形成。这种含有复制泡的复制中间体的形状类似于希腊字母θ型结构。

(3)用途

克隆的DNA片段以单链形式输出细胞,制备单链的DNA用于测序、杂交探针、基因定点突变。

M13重组分子筛选简便 ,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢,形成混浊斑,易于辨认挑选。而且重组分子越大,混浊斑的混浊度亦越大。

M13的RFDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在,很容易纯化出来作为基因克隆的载体使用。

八、COS质粒(柯斯质粒)

(1)概念

柯斯质粒是一类人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。

(2)构建思路

在包装上限固定的条件下,大幅度缩短噬菌体DNA的长度,就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起,既能最大限度地缩短载体的长度,同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒。

(3)特点

具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒,并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制,但是不会形成新的噬菌体颗粒,也不能发生溶菌现象。

具有质粒载体的特性。能象质粒一样在寄主细胞内复制,且带有抗性选择标记基因,有些还带有插入失活型的多克隆位点,为重组体的筛选提供了方便。

高容量的克隆能力。cos质粒本身很小,只有复制起点、选择标记和cos位点等构成,所以其克隆上限可达45 kb左右。不过由于包装的限制,其克隆片段至少要达到30 kb。

九、人工染色体

酵母人造染色体载体(YAC)

细菌人造染色体(BAC)

第四章 核算操作技术

一、核酸提取纯化

(1)提取方法和适用范围

CTAB法

植物基因组DNA提取经典方法

SDS法

动物基因组DNA

碱裂解法

提取质粒

差速离心法

提取细胞器DNA

(2)常见问题

① DNA样品不纯

② DNA降解

③ DNA提取量少

(3)RNA提取方法

异硫氰酸胍/苯酚法

细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解,同时核蛋白体上的蛋白变性,核酸释放

苯酚/氯仿抽提去除杂物

(4)如何避免RNA降解

对于新鲜细胞或组织:

裂解液的质量

外源RNase的污染

裂解液的用量不足

组织裂解不充分

另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏,胸腺等),很难避免 RNA 的降解。

对于冷冻样品:

样品取材后应立即置于液氮中速冻,然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点;

先用液氮研磨,再加裂解液匀浆;

样品与裂解液充分接触前避免融化,研磨用具必须预冷,碾磨过程中及时补充液氮。

二、检测保存

核酸样品的浓度的测定,一般采用紫外光谱分析、荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。

影响保存的关键因素

保存液的pH值

过酸或过碱均可能使氢键解离,导致核酸不稳定。

保存温度

温度升高会增加核酸的分子内能,对维持核酸结构的稳定性不利。

三、电泳

(1)琼脂糖凝胶电泳

电荷效应和分子筛效应。

(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

四、杂交

(1)概念

分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法,用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子,以及其相对分子量大小。

(2)分类及应用

Southern杂交

是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。

Northern杂交

用已知DNA探针杂交未知RNA。

菌落原位杂交

直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列的菌落。

Western杂交

将蛋白质电泳、印迹和免疫检测结合在一起的检测方法,具有很高的灵敏度,可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达蛋白。

Eastern杂交

也是一种蛋白质印迹法,与Western印迹法不同之处是:先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)分离蛋白质,然后也是将蛋白质的分离区带、以电驱动转移方式进行了印迹。

第五章 PCR

一、原理

(1)成分

DNA模板

Taq DNA聚合酶

DNA引物

4种dNTP

Mg2+

反应缓冲液

(2)过程

变性:加热至93-94℃左右一定时间后,模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备

退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合

延伸:模板--引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对原则与半保留复制原理,合成一条新的与模板互补的DNA 链。

(3)体系

ddH2O(调整反应体积)

10 X 缓冲液(按反应体系加入)

4种dNTP混合物(各200umol/L)

引物 1(10~100pmol)

引物 2(10~100pmol)

模板DNA (0.1~2μg)

Taq DNA聚合酶(2.5U)

Mg2+(1.5mmol/L)

(4)参数

变性:95℃(根据酶) 20-30秒

退火:由引物长度和GC含量决定。

延伸:70-75℃

循环次数:一般为25-35次

二、引物设计

上游引物和反义链互补,和有义链方向一致,下游引物反之

第六章 文库

一、基因组文库

(1)概念与方法

用适当的方法将某一种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段,并将这些片段与适当的载体进行体外重组;再引入到适当的宿主细胞中繁殖和扩增,从而形成含有重组DNA分子的群体。

从理论上讲,这些重组子包含有整个基因组DNA序列,即包含了该种生物的全部基因,故称之为基因组文库。

(2)文库的大小

一个基因文库应该包含的克隆数目与该生物基因组的大小和被克隆DNA的长度有关。

基因组越大,所需克隆数就越多。克隆时每一个载体中允许容纳外源DNA片段越长,则所需克隆数越少。

所以为了达到一种合理的几率以克隆到全部基因,一个完整的基因组文库就必须含有3-10倍于最低重组克隆数的克隆。

二、cDNA文库

(1)概念与方法

利用纯化的总mRNA在逆转录酶作用下合成互补的DNA即cDNA,再按上述构建基因文库的类似方法对cDNA片段进行克隆,由此获得的克隆群体。

(2)文库大小

通常表达的基因仅占基因总数的15%



第七章 DNA的重组和转移

一、基因重组

(1)重组思路

基因重组是依赖于限制酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用,分别对外源目的基因片段和载体DNA进行适当切割和修饰后,将二者巧妙的连接在一起,再导入受体细胞,实现目的基因正确表达的过程。

(2)连接方式

① 粘性末端连接

方式:

同一限制酶切位点连接(正向反向连接个50%机会)

不同限制酶切位点连接

配伍末端连接(和同一限制酶切位点连接相似)

非配伍末端连接

② 平端连接

适用于:限制性内切酶切割产生的平端

粘端补齐或切平形成的平端

使用T4连接酶进行连接

③ 同聚物加尾连接

在末端转移酶(terminal transferase)的作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。

④ 人工接头(linker)连接

由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。

(3)操作步骤



二、基因转移

(1)相关概念

受体细胞(receptor cell):又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等,从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。

感受态(competence):细胞处于能够吸收DNA的状态,称为感受态。

感受态细胞(competence cell):处于能够吸收DNA状态的细胞。

转化(transformation):指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。

转染(transfection):指病毒及其重组子导入受体细胞的过程.

转导(transduction):指噬菌体及其重组子导入受体细胞的过程

(2)受体细胞选择原则

① 便于重组DNA分子的导入。

② 便于重组体的筛选。

③易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。

④ 受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低,利于外源蛋白表达产物在细胞内积累,可促进外源基因高效分泌表达。

⑤ 安全性高,无致病性,不会对外界环境造成生物污染。

⑥ 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。

⑦ 受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。

⑧ 具有较好的转译后加工机制等,便于真核目的基因的高效表达。

⑨ 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。

(3)影响转化率的因素

载体本身的性质

载体的空间构象

插入片段的大小

受体细胞必须与载体相匹配

受体细胞的预处理(影响最大)

供受体的比例

转化方法

(4)转化方法

原核细胞转化:

氯化钙法:细菌处于0℃和低渗氯化钙溶液中,细菌细胞壁和膜通透性增加,菌体膨胀成球形,此时转化混合物中DNA形成抗DNA羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面,经短暂热休克(42℃)后,细胞膜形成许多间隙,DNA进入细胞内。

电穿孔法:是指在一个较大的电脉冲中短暂破坏细胞膜的脂质双层,从而允许DNA等分子通过细胞膜进入细胞,而后细胞膜快速复原,保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。

真核细胞转化:

逆转录病毒感染

磷酸钙沉淀法:细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力。将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐,生成DNA-磷酸钙沉淀,加入培养液中。由于细胞的吞噬作用,DNA-磷酸钙沉淀物进入细胞,DNA释出后先进入细胞质、再进入细胞核,整合到受体细胞的染色体上。

脂质体介导法:脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构;形成囊状结构可将DNA包入其中;带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞,达到基因转移的目的

血影细胞介导法血影细胞:哺乳动物细胞溶血,使血红蛋白大量逸出,最后成为仅有被细胞膜包被的细胞核结构。血红蛋白大量逸出时,外源DNA也容易进入。让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合,从而使外源DNA导入受体细胞

第八章 筛选鉴定

一、筛选步骤



二、表型筛选

(1)插入失活法

原理:

质粒具有两种抗性,转入质粒的可在抗性上存活,使用影印法后在双抗平板上无法存活的为重组子。

例子:

pBR322

(2)插入表达法

原理:

质粒含有抗性基因,被转入的细胞在抗性平板上可存活。或外源基因插入抗性基因的负调控基因,准入重组子的转化子可存活。

例子:

pTR262质粒载体,由pBR322衍生而来,其Tcr基因的上游含有一段CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列,CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。

(3)显色法

载体分子上携带某种显色酶基因,其表达产物能使细胞产生颜色反应,从而易于辨认和挑选,如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因(蓝色反应)、链霉菌质粒IJ702携带的melC基因(黑色反应)等。

三、结构特征筛选

(1)酶切法

对载体上插入的外源DNA片段进行酶切分析,并以此与目的基因的已知图谱对比,因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子,而且还能鉴定目的重组子。

(2)PCR法

依据外源DNA片段设计引物进行PCR扩增,重组子能扩增出特异条带。

(3)测序

第九章 表达

一、基因表达总览



二、原核表达

(1)表达条件

① 通过表达载体将外源基因导入宿主菌,利用宿主菌的酶系统合成外源蛋白。

② 外源基因不能带有间隔顺序(内含子),因而真核生物基因必须用cDNA或全化学合成。

③ 必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。

④ 外源基因与表达载体连接后,必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。

⑤ 利用宿主菌的调控系统,调节外源基因的表达,防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。

(2)大肠杆菌表达系统

大肠杆菌基因表达载体:

大肠杆菌基因表达载体的构建,应包括这些基因元件:复制子、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、选择标记等。

受体菌:

造成重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因包括:

大肠杆菌缺乏复杂翻译后加工和蛋白质折叠系统。

大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物的稳定因子。

大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境,导致蛋白质分子之间的作用增强。

为了使外源基因高效表达,必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌株。

(3)表达的部位和形式

① 包涵体

包涵体:在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)。

外源基因表达产物在细菌内的存在形式有可溶性和不可溶性两种方式。表达产物在宿主中的存在形式是可变的。培养基的营养状况好,诱导表达的时间短,降低表达效率都有利于可溶性表达产物的形成。反之则容易形成不可溶性的表达产物即包涵体。

包涵体表达能简化外源基因表达产物的分离操作,能在一定程度上保持表达产物的结构稳定,但以包涵体形式表达的重组蛋白无生物活性,必须通过有效的变性复性操作,才能回收得到具有正确空间构象(具有生物活性)的目标蛋白。 体外复性蛋白质的成功率相当低,一般不超过30%。

② 外源蛋白的分泌表达

分泌表达的外源蛋白可存在于细胞周质或细胞外培养基中。

周质:在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中,位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。

分泌表达的目的蛋白稳定性高、易于分离、目的蛋白末端完整。但相对其它生物细胞而言,大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达,少数外源基因即使能分泌表达,其表达率要比包涵体方式低很多。

(4)提高表达效率的方法

① 优化表达载体的设计(启动子快速启动可调控、核糖体结合位点有效、转录终止区有效)

② 增加表达质粒的拷贝数和稳定性

③ 提高翻译水平的效率(SD序列与起始密码子之间距离以9±3碱基为适宜,尽量避免使用罕用密码子,增加mRNA的稳定性)

④ 减轻细胞的代谢负荷,进行可控制的诱导表达

三、真核表达

(1)真核基因的表达特点

① 一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽,不存在原核生物那样的多基因操纵子模式;

② 基因转录调节区很大,且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基,它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合,而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合;

③ mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作,而且通常都有复杂的成熟和剪接过程;

④ 基因的启动子区和原核基因差异很大,而且有增强子序列存在。

(2)酵母表达系统

载体:

均为大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。有附加体型载体和整合体型载体两种。常用启动子:GAL1、AOX1、AUG1、TEF1 等。

整合型载体: 导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合,稳定性高,但基因拷贝数低。

附加体型载体:在酵母宿主中拷贝数量大,但在传代过程中易丢失,影响重组菌的稳定性和表达量。

(3)哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统,是目前应用最广泛的动物细胞表达系统。它的表达产物质量极高,但产量低、成本高。

(4)病毒性载体系统

包括逆转录病毒载体及其它DNA病毒载体。

(5)动物/植物表达系统(转基因动物/植物)

转基因动物指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞,使外源基因与动物本身的基因组整合,并随细胞的分裂而增殖,从而将外源基因稳定的遗传给下一代的工程化动物。

(6)外源基因在真核细胞中的两种表达方式

① 瞬时表达

在受体中表达一个细胞周期或一个培养周期,这种表达称瞬时表达。

瞬时表达的效率取决于吸收DNA的细胞数、基因拷贝数和基因的表达水平,在瞬时表达系统中,吸收DNA的细胞数约为5%~50%。因为没有整合,随着细胞的生长,细胞群体中外源基因的含量逐步减少,最后消失。因此瞬时表达系统只能使用数天。

瞬时表达常用于下列方面:

根据表达活性确证分离到的基因;

研究诱变对蛋白质活性和功能的影响;

分离cDNA文库中的基因。

② 稳定表达系统

如果在转染DNA后进行筛选,则可能得到外源基因整合到染色体中的稳定表达的细胞。不同品系的细胞转染和整合DNA的能力不同,而在筛选获得稳定表达的细胞过程中,整合的能力比转染的能力更重要。

常用的稳定表达宿主细胞是CHO细胞,它来自中国仓鼠卵巢细胞。

四、主要基因工程表达体系比较



第十章 植物基因工程

一、植物基因工程的思路

目的基因的来源

目的基因的运载工具

转化受体系统

基因导入方法

阳性植株的筛选鉴定

二、目的基因的来源

三、载体和菌株

(1)农杆菌

根癌农杆菌:植物细胞被侵染后形成肿瘤,能够诱发冠瘿瘤

发根农杆菌:诱发毛发状根

(2)Ti质粒

农杆菌Ti质粒整合到植物染色体的农杆菌的质粒DNA,称为转移DNA,简称T-DNA。

① 结构与元件



Ori区:复制起始位点

Con区:与细菌间接合转移的有关基因tra

Vir区:该区段上的基因能激活T-DNA转移使农杆菌显出毒性

T-DNA区:农杆菌感染植物细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA

② 卸甲载体

在构建一元载体过程中,将Ti质粒上T-DNA中的致瘤基因全部去掉,仅保留其两侧边界与T-DNA准确转移所必需的25个碱基序列的Ti质粒。

③ 双元载体

由两个分别含有T-DNA和Vir区的兼容性Ti质粒构成的双质粒系统。

(3)转化过程



四、受体

(1)愈伤组织再生系统

优点:

① 愈伤组织是由脱分化的分生组织组成,细胞活跃,分裂旺盛,易于接受外源基因,转化率高。

② 愈伤组织可继代扩繁,因而由转化愈伤可培养获得大量的转化植株。

③ 外植体材料广泛,多种组织、器官均可诱导愈伤组织。

④ 以愈伤组织为转化受体,获得的转基因植株一般不存在嵌合体现象。

(2)原生质体

优点:

① 由于无细胞壁,能直接高效地摄取外源DNA,甚至细胞核。

② 由原生质形成的愈伤组织由于是单细胞来源,嵌合体少。

缺点:

原生质培养周期长、再生频率低,因此局限性较大。

(3)生殖细胞受体














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